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一、實(shí)驗(yàn)介紹

早期的shRNA載體多採用RNA聚合酶III型啟動(dòng)子介導(dǎo)shRNA的表達(dá)，RNA聚合酶III型啟動(dòng)子如鼠源的U6啟動(dòng)子和人源的H1啟動(dòng)子可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)小分子RNA，隨著miRNA干擾機(jī)制的深入研究，發(fā)展出第二代siRNA載體，即採用RNA聚合酶II型啟動(dòng)子CMW表達(dá)含測(cè)翼序列的miRNA模擬物，該載體模擬miRNA的加工，表達(dá)出來的shRNA進(jìn)入RISC沉默複合物的效率要比RNA聚合酶III型啟動(dòng)子表達(dá)的shRNA高十倍，抑制效率更好，且可以和EGP協(xié)調(diào)表達(dá)，方便觀察轉(zhuǎn)染效率

二、實(shí)驗(yàn)週期

30-35工作日

三、交付標(biāo)準(zhǔn)

 >10ug shRNA載體，已確認(rèn)shRNA目標(biāo)基因轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞株，實(shí)驗(yàn)報(bào)告，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選擇蛋白質(zhì)檢測(cè)或分子生物學(xué)檢測(cè)

四、客戶提供

目的基因NCBI登陸號(hào)

 五、實(shí)驗(yàn)流程

設(shè)計(jì)干擾靶點(diǎn)                                  

構(gòu)建干擾載體         培養(yǎng)293T細(xì)胞       靶基因表達(dá)豐度檢測(cè)    

豐度高-內(nèi)源篩選     干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞       QPCR檢測(cè)干擾效果

豐度低-外源篩選     靶基因真核表達(dá)載體構(gòu)建     干擾質(zhì)粒與表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞     QPCR檢測(cè)干擾效果