Bradford試劑蛋白定量是一種快速、即用型的總蛋白光學(xué)定量方法。在酸性條件下，考馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白質(zhì)疏水區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致最大吸收峰由465 nm變?yōu)?95 nm，同時(shí)顏色也由棕色變?yōu)樗{(lán)色，該藍(lán)色化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度的高低成正比關(guān)系。將蛋白質(zhì)樣品或稀釋的BSA與Bradford試劑混合，測(cè)量在595 nm處的吸收值，在由一系列稀釋的BSA建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下，蛋白質(zhì)的濃度可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線而確定。
Bradford實(shí)驗(yàn)原理：考馬斯亮藍(lán)G250,在游離狀態(tài)下呈棕色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)?/span>藍(lán)色，蛋白質(zhì)—色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量。
一、優(yōu)點(diǎn)
1. 靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1ug。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。
2. 測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。
3.干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K+，Na+，Mg2+離子，Tris緩沖液，糖和蔗糖，甘油，巰基乙醇，EDTA等均不干擾此測(cè)定法。
二、缺點(diǎn)
1. 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。
2. 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有:去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣)。
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。
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