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適用于中等靈敏度檢測各種印跡膜檢測，包括Southern雜交、Northern雜交、Western blot沉淀、免疫組化等。

 

 

三種顯色方法ECL、NBT/BCIP和DAB的對比:

 

1.ECL

增強化學發(fā)光，一般含有魯米諾和H2O2、發(fā)光增強劑等物質。發(fā)光試劑中的魯米諾被HRP和H2O2氧化，產(chǎn)生熒光，這個過程被發(fā)光增強劑加強。其中，增強劑在體系中扮演著核心角色，決定著ECL化學發(fā)光的發(fā)展。

理想的發(fā)光增強劑是：（1）發(fā)光靈敏，目前一般的發(fā)光增強劑都可以將發(fā)光靈敏度提高1000倍至100000倍以上；（2）發(fā)光穩(wěn)定，這是目前研究的重點之一，發(fā)光不穩(wěn)定的增強劑，容易在一些情況下發(fā)生“淬滅”，不容易被檢測到；（3）本底或背景低，這也是發(fā)展的方向之一，欲得到準確可靠的結果，就必須確保試劑的特異性，在無HRP或很少HRP的情況下，不發(fā)光或很少發(fā)光。

 

2.NBT/BCIP:

是堿性磷酸酶最佳的底物組合之一。在堿性磷酸酶（AP）的催化下，BCIP會被水解而產(chǎn)生強反應性產(chǎn)物，該產(chǎn)物與NBT發(fā)生反應，形成不溶性的深藍色至藍紫色化學物。該試劑盒可用于堿性磷酸酶系統(tǒng)的IHC和WB實驗的酶促顯色。在AP的催化下，在組織切片或印跡膜上結合了AP偶聯(lián)物的地方產(chǎn)生深藍色沉淀，可根據(jù)顏色反應來確定目的蛋白的位置及表達情況。

 

3.DAB:

二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是過氧化物酶的顯色底物，在過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化和積累，形成棕褐色不溶性產(chǎn)物，并就地原位沉淀。顯色反應原理如下：

 

HRP＋H2O2+DAB→HRP＋H2O＋氧化型DAB↓

該方法特異性好，性能穩(wěn)定，操作便捷，適用于蛋白質雜交和免疫化學，其終產(chǎn)物可直接在普通環(huán)境下觀察，但靈敏度是這三種方法中最低的，僅能達到500pg。

 

綜合如上所述，ECL和DAB都是HRP的底物，NBT/BCIP的酶是堿性磷酸酶。而且三者的顏色顯示不同，DAB的顯色是棕褐色，NBT/BCIP顯藍色，ECL顯熒光。在靈敏度方面，ECL化學發(fā)光的靈敏度最高，為1~5pg，也有達到fg級的，BCIP/NBT的靈敏度100pg，DAB的靈敏度最低，大約為500pg。在試驗中進行選擇時，可根據(jù)不同的酶以及靈敏度等進行選擇，并且注意操作時應佩戴手套，避免將顯色劑與皮膚接觸，用后及時徹底沖洗。