1 做熒光定量PCR之前，考慮到的是你能接觸到什么機型的PCR儀，不同的PCR儀兼容的耗材以及試劑不一樣的，如果你沒有別人帶，自己第一次做，一定要注意。
2 做熒光定量PCR最重要的莫過于，引物和模板的準備。提取RNA之后一定要電泳檢測其降解狀態(tài)，如果發(fā)生了降解很容易導致結果偏差；引物設計的好壞直接關系著后續(xù)實驗的成功，所以引物合成回來，可以做個普通的pcr，跑電泳驗證其特異性。如果同時要檢測很多的基因，那么設計的時候，引物的Tm最好都相近在60度左右，擴增產(chǎn)物150bp左右最好，有利于操作。
3 熒光定量PCR的體系確定，大的體系容錯率可能稍微高一點，小的體系對操作的精度和準度要求比較高，但是可以很好的的節(jié)省cDNA模板。如果沒有電動的分液槍，要熟練的使用普通移液器。
4 進行具體實驗之前，要測定引物的擴增效率，通常來說，比較兩種處理中基因表達的差異是需要內(nèi)參基因的，這樣的比較，是假定興趣基因引物以及內(nèi)參基因的擴增效率相同且為1的。如果引物太多，可以看熒光定量PCR的擴增曲線，如果形態(tài)相近的話，一般也認為擴增效率是一致的。
5 熒光定量PCR最少設置三個技術性重復組，同時一定要有空白對照組，有很多人沒有這種習慣，其實很危險。
6 熒光定量PCR的程序和普通PCR不同，會多一個melting的部分，同時三步循環(huán)中延伸的部分可以去掉，節(jié)省時間。
7 熒光定量PCR結束之后要去看下溶解度曲線，每種擴增產(chǎn)物的曲線為單峰既Ok
8 數(shù)據(jù)的處理，這部分首先要根據(jù)sd值判斷數(shù)據(jù)質量。如果重復組數(shù)據(jù)波動很大，則會導致結果不可信，當然如果設置的重復組較多，有些明顯的單個異常值可以去掉，優(yōu)化數(shù)據(jù)。最后需要根據(jù)不同的目的來對數(shù)據(jù)進行不同的計算處理。
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